Sequenciador ABI 3730 DNA Analyzer (48 capilares) - CTO/ICESP
[GEF-03 - SDN3]
 
 

Aplicações, Procedimentos e Regras de Utilização - Sequenciamento



PROCEDIMENTOS E REGRAS 

Oferecemos duas opções de serviço por eletroforese capilar (Sanger) para produtos de PCR e plasmídeos:

OPÇÃO 1 - Reação de sequenciamento realizada pelo pesquisador 

O pesquisador faz suas reações e encaminha ao serviço de sequenciamento a placa para ser sequenciada.

A qualidade da amostra de PCR é o ponto mais crítico para o sucesso da reação de sequenciamento. Os fragmentos de DNA ou produtos de PCR devem ser específicos e estar livres de primers, dNTPs, enzimas e tampão. Antes de realizar a reação de sequenciamento é necessário que as amostras sejam purificadas. 

Métodos de purificação sugeridos:
 
- EXO-SAP (sugestão: USB® ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup - USB - PN#72800),
- QIAquick PCR purification kit - Quiagen - PN#28104).
 
Após purificação, as amostras devem ser ressuspendidas em água ultrapura e quantificadas. 

NÃO USAR TE OU OUTRO TIPO DE TAMPÃO PARA RESSUPENDER AS AMOSTRAS, POIS ISSO IRÁ INTERFERIR NO RESULTADO DO SEQUENCIAMENTO.

Recomendamos a quantificação por gel de agarose utilizando marcador Low DNA mass ladder - Invitrogen - PN#10068-013. 

Abaixo, apresentamos um exemplo de gel de agarose para quantificação e análise de qualidade da amostra com a utilização do marcador Low DNA mass ladder:

A quantidade de amostra para ser sequenciada deve seguir a tabela abaixo:

Amostra - Produto de PCRQuantidade
100-200 pb1-3 ng
200-500 pb3-10 ng
500-1000 pb5-20 ng
1000 - 2000 pb10-40 ng
>2000 pb20-50 ng


A reação deve ser realizada utilizando o reagente BigDye Terminator v3.1 cycle sequencing kit (http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/cms_081527.pdf).

Sugerimos o protocolo de reação abaixo:

ReagenteVolume
Ready Reaction Premix 2,5X2,0 µl
BigDye Sequencing buffer 5X1,0 µl
Primer 5mM1,0 µl
AmostraVide tabela
água qsp 10 µl


Sugestão de programa para amplificação a ser utilizado:

1 ciclo:96oC por 1 min
35 ciclos:96oC por 15 seg.
50oC por 15 seg.
60oC por 4 min.
Hold:4oC

Após reação, os produtos deverão ser precipitados de acordo com o protocolo sugerido no Kit BigDye Terminator v3.1 (http://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/brochures/cms_081527.pdf)

Sugerimos o protocolo de precipitação abaixo:

Os produtos podem ser precipitados utilizando-se etanol e EDTA. Aos 10 µl de reação, adiciona-se 2,5 µl de EDTA 125 mM e 30 µl de etanol absoluto. Em caso de precipitação em placa, esta deve ser fechada com adesivo resistente a etanol. Os produtos devem ser homogeneizados por inversão por várias vezes. A reação deve ser incubada por 15 minutos a temperatura ambiente protegida da luz. Após incubação, o produto deve ser centrifugado a 2000 g por 30 minutos a temperatura ambiente (em torno de 22°C). O sobrenadante deve ser descartado e ao precipitado é adicionado 30 µl de etanol 70%. O produto deve ser centrifugado novamente a 1650 g por 15 minutos. O sobrenadante deve ser descartado e a placa deve ser bem seca.

As amostras devem ser enviadas ao serviço de sequenciamento secas (sem serem ressuspendidas) em placas* ou em tubos de 0,2ml .

* No caso do fornecimento de amostras em placas, serão aceitas no mínimo 46 amostras e no máximo 94 amostras. É obrigatório que dois poços da placa fiquem vazios para a inclusão dos controles de reação.

Devido à conformação dos capilares do equipamento 3730, as amostras deverão ser dispostas na placa em colunas, preenchendo-se primeiro as colunas ímpares (vide esquema a seguir). Solicita-se que as reações sejam feitas em placas de 96 poços modelo MicroAmp Optical 96 well reaction plates - Applied Biosystems - PN#4306737, 4326659

sdna_desenho_placa.jpg

IMPORTANTE: Consulte as orientações de envio de amostras, abaixo, para orientações quanto ao procedimento para envio dos tubos e placas.

 


 
OPÇÃO 2 - Reação de sequenciamento realizada pelo serviço

O pesquisador fornece os produtos de PCR (ou plasmídeos) e os primers, e o técnico do serviço realiza as reações.

A qualidade da amostra de PCR é o ponto mais crítico para o sucesso da reação de sequenciamento. Os fragmentos de DNA ou produtos de PCR devem ser específicos e estar livres de primers, dNTPs, enzimas e tampão. Antes de realizar a reação de sequenciamento é necessário que as amostras sejam purificadas.
 
Métodos de purificação sugeridos:
 
- EXO-SAP (sugestão: USB® ExoSAP-IT® PCR Product Cleanup - USB - PN#72800),
- QIAquick PCR purification kit - Quiagen - PN#28104).

Após purificação as amostras devem ser ressuspendidas em água ultrapura e quantificadas.

NÃO USAR TE OU OUTRO TIPO DE TAMPÃO PARA RESSUPENDER AS AMOSTRAS, POIS ISSO IRÁ INTERFERIR NO RESULTADO DO SEQUENCIAMENTO

Recomendamos a quantificação por gel de agarose utilizando marcador Low DNA mass ladder - Invitrogen - PN#10068-013. A foto do gel quantitativo deve ser enviada no momento do preenchimento do formulário de solicitação, antes do envio das amostras, para avaliação do técnico do serviço de sequenciamento. Essa foto deve conter o nome da amostra, volume de amostra aplicado no gel e concentração (ng/µl) das amostras, bem como suas respectivas posições no gel. Devem ser indicados o nome e volume de marcador utilizado. Serão aceitos somente arquivos em formato pdf.

Abaixo apresentamos um exemplo de gel de agarose para quantificação e análise de qualidade da amostra com a utilização do marcador Low DNA mass ladder:

A SOLICITAÇÃO DE SERVIÇO NÃO SERÁ EFETUADA SEM O ENVIO PRÉVIO DA FOTO DO GEL QUANTITATIVO E APROVAÇÃO DA QUALIDADE E CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS PELO SERVIÇO.


A quantidade de amostra para ser sequenciada deve seguir a tabela abaixo:

AmostraQuantidade
Produto de PCR:
100-200 pb
1-3 ng
200-500 pb3-10 ng
500-1000 pb5-20 ng
1000-2000 pb10-40 ng
>2000 pb20-50 ng


As amostras deverão ser encaminhadas na concentração adequada de acordo com a tabela acima e no volume mínimo de 5 µl. Para as informações detalhadas para envio das amostras consulte, abaixo, as orientações para envio de amostras.



Orientações para o Envio da Amostra

As amostras podem ser entregues pessoalmente, de segunda a sexta feira das 8h00 às 12h00 e das 13h00 às 16h30, ou através de serviços de correio no seguinte endereço:

Instituto do Câncer do Estado de São Paulo
Centro de Investigação Translacional em Oncologia - CTO
Av. Dr Arnaldo, 251, 8º andar, sala 2 (Laboratório de Genética Molecular)
Contato: Flávia Rotea Mangone, Ana Carolina Pavanelli
Fone: 3893-3007 / 3893-3006

As amostras devem ser acondicionadas em isopor com gelo picado. As amostras encaminhadas por serviço de correio devem ser acondicionadas com gelo reciclável.

Amostras recebidas às terças feiras até 12h00 serão processadas na mesma semana. Material entregue fora desta data entrará na rotina da semana seguinte. A entrega das amostras poderá ser agendada após recebimento da aprovação do serviço que será enviada para o e-mail do solicitante.

PARA ENCAMINHAMENTO DAS AMOSTRAS E SOLICITAÇÃO DE SERVIÇO É NECESSÁRIO QUE O CLIENTE SE CADASTRE E SOLICITE O SERVIÇO PELA REDE PREMIUM - NOS LINKS CADASTRO E SOLICITAÇÕES

Orientações para identificação das amostras:
 
Os tubos de amostras, bem como os respectivos formulários de encaminhamento, devem ser identificados com as iniciais do nome do pesquisador responsável mais caracteres em ordem numérica. 
Por exemplo: pesquisador responsável - Elisabete Cristina Miracca, identificar os tubos como ECM1, ECM2, ECM3, em diante. 

Para clientes que optarem pela opção 1, as amostras poderão ser fornecidas em tubos ou em placas.
 
Em caso de fornecimento das amostras em placas identificar não só as amostras como também a placa, com as iniciais do pesquisador mais número de placa. 
Por exemplo: pesquisador responsável - Elisabete Cristina Miracca, identificar ECM-placa 1, ECM-placa 2, em diante. 

LEMBRE-SE QUE DEVERÃO SER DEIXADOS DOIS POÇOS DA PLACA PARA COLOCAÇÃO DOS CONTROLES DE REAÇÃO E QUE NÃO SERÃO ACEITAS AMOSTRAS EM PLACA EM UM NÚMERO INFERIOR A 46 AMOSTRAS.

Para clientes que optarem pela opção 2, as amostras deverão ser fornecidas obrigatoriamente em tubos e a foto do gel quantitativo deve ser enviada no momento do preenchimento do formulário de solicitação, antes do envio das amostras, para avaliação do técnico do serviço de sequenciamento
Para maiores informações sobre a qualidade e quantificação das amostras, Consulte as orientações descritas na opção 2.
 
Mediante a aprovação da qualidade, as amostras deverão ser enviadas em tubos de 0,2 mL no volume de 5 µL. O primer para sequenciamento deverá ser fornecido na concentração de 5 µM no volume suficiente para o total de amostras a serem sequenciadas considerando-se 2 µL por amostra. A identificação do tubo de primer e do tubo da amostra deve ser idêntica ao descrito no formulário de solicitação.

A SOLICITAÇÃO DE SERVIÇO NÃO SERÁ EFETUADA SEM O ENVIO PRÉVIO DA FOTO DO GEL QUANTITATIVO E APROVAÇÃO DA QUALIDADE E CONCENTRAÇÃO DAS AMOSTRAS PELO SERVIÇO.

Todas as amostras e primers remanescentes serão estocados pelo prazo máximo de 1 mês após a data de recebimento, podendo ser retiradas até esta data pessoalmente em nosso serviço. Não haverá devolução de amostra por serviço de correios ou similares.

 


Prazo para Entrega de Resultados:

Para a Opção 1, o prazo de entrega de resultados é 7 dias úteis.
Para a Opção 2, o prazo de entrega dos resultados é de 14 dias úteis.

Serão enviados arquivos no formato .ab1, sendo cada arquivo correspondente a amostra enviada. Os arquivos podem ser abertos com o Chromas, BioEdit ou Sequencer Scanner, que podem ser obtidos gratuitamente pela internet.
 
 

 

OBSERVAÇÃO: O controle de qualidade das reações é feito utilizando-se o pGEM e o primer M13, que são fornecidos no kit de sequenciamento. As reações destes controles serão realizadas pelo serviço de sequenciamento independente da opção escolhida pelo cliente, e serão sequenciadas em conjunto com as amostras servindo como controle de qualidade do serviço. Caso seja constatado que as reações do controle não funcionaram ou não tiveram a qualidade satisfatória, as reações do cliente serão repetidas sem nenhum custo adicional. 

No entanto, as amostras dos clientes que não tiverem resultado satisfatório deverão ser pagas da mesma maneira, uma vez que seja comprovada a qualidade do controle da reação.

 






 

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